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生物膜（biofilm）也稱為生物被膜，是指附著于有生命或無生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體。由于生物膜在環(huán)境中隨處可見，對抗生素抗性很強(qiáng)，因此，生物膜形成機(jī)理及調(diào)控吸引了很多研究人員的注意。我們使用土壤細(xì)菌，熒光假單胞菌作為模式生物，研究如何控制這種細(xì)菌生物膜的形成。

Shiro Yoshioka 說：“Phenom ProX 和 ParticleMetric 軟件結(jié)合使用，有效地統(tǒng)計(jì)出生物膜中的桿形細(xì)菌的尺寸信息”

轉(zhuǎn)座子突變通常用于標(biāo)識(shí)所需的生物膜形成的基因。將轉(zhuǎn)座子插入到參與生物膜的形成的基因中，該突變體可以顯示基于這種基因，生物膜形成增加或減少情況。通過這種技術(shù)，我們找到了負(fù)責(zé)合成細(xì)菌第二信使的一種基因。

相對于與野生型菌株，c-di-GMP 的損失引起了生物膜形成的減少。在本次研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，破壞 de novo 嘌呤核苷酸生物合成的一個(gè)基因也可以引起生物膜形成的減少。因?yàn)檫@種基因?qū)τ谏锖铣赏緩缴系闹匾栽诙喾N細(xì)菌上被報(bào)導(dǎo)，我們研究了這些突變體，弄清了這種生物合成途徑與熒光假單胞菌生物膜形成之間的關(guān)系。

Phenom ProX 對于生物膜研究的應(yīng)用

雖然突變體形成的生物膜減至不到 WT 的一半，細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，生物膜中的突變細(xì)胞數(shù)目與 WT 相當(dāng)。要解釋這一結(jié)果，我們推測突變體在生物膜中的細(xì)胞尺寸變得比 WT 更小。換句話說，突變引起生物膜細(xì)胞細(xì)胞尺寸減少。這種假設(shè)也有依據(jù)，因?yàn)橥蛔凅w不能合成 AMP 和 GMP，可能導(dǎo)致突變體的增長放緩。

掃描電子顯微鏡 (SEM) 是檢查細(xì)菌生物膜中細(xì)胞大小的*方法之一。為了獲取有關(guān)生物膜中細(xì)菌細(xì)胞的尺寸信息，我們使用一個(gè)桌面掃描電鏡，Phenom ProX，使得我們可以樣品制備后的一分鐘內(nèi)獲得掃描電鏡圖像。這快的速度使得我們可以針對每個(gè)突變采集多張顯微照片以便通過 ParticleMetric 軟件進(jìn)一步詳細(xì)分析。圖 1 為 Phenom ProX 拍攝的熒光假單胞菌清晰的圖片。

圖 1

生長在聚氯乙烯表面熒光假單胞菌生物膜細(xì)胞的掃描電鏡圖像 (放大倍率︰ 12，000 x)

飛納電鏡 Phenom ParticleMetric 軟件的強(qiáng)大力量

掃描電鏡圖像比較明確顯示出突變體的尺寸發(fā)生了減小。然而，它很難定量描述 WT 和突變體細(xì)胞大小的區(qū)別。Phenom ProX 的 ParticleMetric  軟件能夠快速識(shí)別掃描電鏡圖像中的每個(gè)細(xì)胞的各種參數(shù)。因?yàn)闊晒饧賳伟菞U形的，外接的圓直徑可以很好的近似為細(xì)胞的長度。使用此軟件，我們從幾個(gè)掃描電鏡圖像中收集超過 1,500 的單個(gè)細(xì)胞的外接的圓直徑，創(chuàng)建直方圖，并計(jì)算相關(guān)的外接的圓直徑 (圖 2) 中位數(shù)。

Phenom ParticleMetric  軟件自動(dòng)執(zhí)行此過程。我們*的關(guān)注點(diǎn)的是自動(dòng)顆粒檢測有時(shí)將聚集細(xì)胞視為單個(gè)細(xì)胞。ParticleMetric 允許直觀地從數(shù)據(jù)中移除這種細(xì)胞。計(jì)算的結(jié)果顯示，該突變細(xì)胞的長度相對于 WT 比縮減了 25 ~ 30%。因此，Phenom ProX 和 ParticleMetric 軟件的證據(jù)，成功地證明了我們做出的“突變的細(xì)胞在生物膜中相對于 WT 變得更小”的假設(shè)。

圖 2
ParticleMetric 軟件生成的統(tǒng)計(jì)了超過 1,500 個(gè)熒光假單胞菌生物膜細(xì)胞的外接圓直徑的直方圖，外接的圓直徑的中位數(shù)計(jì)算結(jié)果是 1.79µm，除了直方圖，也可以顯示任何一個(gè)選定細(xì)胞的參數(shù)

結(jié)論

Phenom ProX 桌面掃描電鏡和 ParticleMetric 軟件有效地統(tǒng)計(jì)了生物膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的大小數(shù)據(jù)，對生物膜研究中的應(yīng)用提供有價(jià)值的信息。因?yàn)樵S多細(xì)菌由于養(yǎng)分有效性或抗生素而改變它們的大小和形態(tài)，在細(xì)胞的大小和形態(tài)的識(shí)別與統(tǒng)計(jì)將是未來的研究在生物膜研究的必要條件。Phenom ProX 和簡單易用快速的 ParticleMetric 軟件將為微生物的研究人員提供很大的幫助。